-植物“基因剪刀”銳度“升級”——科學(xué)家開發(fā)植物高效引導(dǎo)編輯設(shè)計策略及平臺
作者:韓揚眉
發(fā)布時間:2021-03-30
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-植物“基因剪刀”銳度“升級”——科學(xué)家開發(fā)植物高效引導(dǎo)編輯設(shè)計策略及平臺

■本報記者 韓揚眉

剪切、復(fù)制、粘貼,消除不需要的基因片段,換上想要的基因片段,這就是基因組編輯技術(shù)。這把“基因剪刀”被科學(xué)家應(yīng)用在各種動植物的基因修復(fù)與改造中,為醫(yī)學(xué)、健康、農(nóng)業(yè)等帶來了突破性革命。

為了更精準(zhǔn)地實現(xiàn)基因組編輯,近年來,科學(xué)家不斷探索更多方法發(fā)展基因組編輯技術(shù)。

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所研究員高彩霞團隊與中國科學(xué)院院士李家洋團隊合作開發(fā)了高效設(shè)計pegRNA,以及提高植物引導(dǎo)編輯效率的新策略,為實現(xiàn)植物基因組功能解析和作物精準(zhǔn)育種提供了強有力的技術(shù)支撐。相關(guān)研究成果近日在線發(fā)表于《自然—生物技術(shù)》。

更精準(zhǔn)的“夢想”

2019年10月,美國哈佛大學(xué)教授劉如謙團隊開發(fā)了全新的基因組引導(dǎo)編輯技術(shù)(Prime Editing)。該技術(shù)能夠在基因組的靶位點處實現(xiàn)片段的精準(zhǔn)插入、刪除及堿基的任意替換,被稱為是“超越CRISPR”的重大突破。

引導(dǎo)編輯系統(tǒng)由兩部分構(gòu)成:一是nCas9(H840A)與工程化改造的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)組成的融合蛋白;二是包含PBS序列和RT模板序列的pegRNA。

2020年,高彩霞團隊擴展了引導(dǎo)編輯技術(shù)的應(yīng)用,首次在水稻和小麥中成功建立并優(yōu)化了適用于植物的引導(dǎo)編輯器(PPE),為實現(xiàn)農(nóng)作物精準(zhǔn)基因組編輯提供了技術(shù)支撐。

“目前的引導(dǎo)編輯器在植物中的工作效率依舊偏低,需要進一步優(yōu)化?!备卟氏几嬖V《中國科學(xué)報》,“我們之前的研究發(fā)現(xiàn)植物引導(dǎo)編輯效率很大程度上受到PBS序列和RT模板序列的影響,這暗示著對pegRNA序列進行合理設(shè)計有助提高引導(dǎo)編輯效率?!?/p>

兩種新策略

如何提升引導(dǎo)編輯效率并快速獲取高效形式的pegRNA,是植物引導(dǎo)編輯技術(shù)亟須解決的問題。

一開始,研究人員篩選了高效形式的pegRNA,并希望能找到一般性規(guī)律。 然而,事與愿違。常規(guī)實驗方法費時費力,限制了引導(dǎo)編輯技術(shù)在植物中的應(yīng)用。

于是,研究人員另辟新路。

由于引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的PBS序列與非靶標(biāo)鏈結(jié)合是起始逆轉(zhuǎn)錄過程的重要條件,而熔解溫度(Tm)決定了兩條鏈結(jié)合的緊密程度,因此他們推測PBS的Tm值有可能對引導(dǎo)系統(tǒng)的編輯效率有重要影響。

為驗證推測,研究人員在18個內(nèi)源位點進行了測試。結(jié)果表明,當(dāng)PBS的Tm值為30℃左右時,引導(dǎo)編輯效率在多數(shù)水稻內(nèi)源位點上達(dá)到最高,并且隨著溫度的增高或降低均呈現(xiàn)遞減的趨勢。這也驗證了他們的猜想。

研究人員還設(shè)想,為一個DNA位點的正鏈和負(fù)鏈各設(shè)計一個pegRNA,利用DNA兩條鏈之間存在的反向互補序列,同時“啟動”細(xì)胞中的其他修復(fù)途徑,共同提高引導(dǎo)編輯系統(tǒng)效率。

他們在15個水稻內(nèi)源位點測試了該策略。結(jié)果表明,該策略與分別遞送單個pegRNA方法相比效率平均可以提升3倍。他們將該改進策略命名為“雙pegRNA策略”。

另外,實驗還表明,運用SpG變體可以進一步拓展雙pegRNA策略的編輯范圍。

建立新平臺

對于這一成果,國際同行專家給出了高度評價:“鑒于引導(dǎo)編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展,該工作將對基因組編輯領(lǐng)域產(chǎn)生很大影響?!?/p>

“pegRNA的設(shè)計相對復(fù)雜。如何建立一個平臺,幫助科研人員針對所需位點進行合理的設(shè)計,并構(gòu)建高效的引導(dǎo)編輯策略,以方便大家使用,在這方面李家洋團隊非常有經(jīng)驗?!备卟氏颊f。

為此,基于上述兩個策略,研究人員開發(fā)了植物pegRNA設(shè)計網(wǎng)站PlantPegDesigner。

該網(wǎng)站可以提供一系列參數(shù)供使用者根據(jù)需要進行個性化選擇,并可以推薦完整的pegRNA選擇、設(shè)計與構(gòu)建方案,方便使用者快速篩選高活性pegRNA。實驗結(jié)果表明,與常規(guī)設(shè)計方案或其他pegRNA設(shè)計網(wǎng)站相比,該網(wǎng)站設(shè)計的pegRNA具有更高的編輯效率。

專家指出,實現(xiàn)重要農(nóng)作物精準(zhǔn)基因組編輯對加快農(nóng)作物遺傳改良進程具有重要意義。下一步,研究團隊將繼續(xù)優(yōu)化策略,提升網(wǎng)站平臺,為作物品種改良等提供更高效、精準(zhǔn)的新工具。

相關(guān)論文信息:

https://doi.org/10.1038/s41587-021-00868-w

《中國科學(xué)報》 (2021-03-30 第1版 要聞)



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